Metode Strerilisasi

Saat ini informasi yang diperoleh dari bidang mikrobiologi memberikan sumbangan yang sangat besar, khususnya dalam mengawasi penyakit menular. Selain itu, mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai proses biokimia yang diketahui terjadi pula pada bentuk kehidupan yang lebih tinggi. Banyak fakta tentang metabolisme manusia yang diketahui sekarang mula-mula diketahui terjadi pada mikroorganisme. Demikian pula dengan teknologi yang sekarang sedang popular, misal Rekayasa Genetik, yang tidak lain merupakan perkembangan genetika molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel.Semua ini berasal dari studi tentang mikroorganisme. Jadi, bidang mikrobiologi tidak hanya studi tentang penyebab penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati mikroorganisme.

Mikroorganisme banyak dipelajari di laboratorium untuk banyak tujuan. Derajat perinciannya untuk mempelajari itu tergantung kepada maksud pemerikasaan laboratories tersebut. Tersedianya pula teknik untuk menentukan ukuran,bentuk, danstruktur sel-sel individu serta beberapa prosedur untuk menumbuhkan (membiakkan) mikroorganisme di laboratorium.

Pada bahasan berikut ini dititikberatkan pada metode/prosedur untukmembebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan atau yang biasannya dikenal dengan istilah sterilisasi.Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1.     Sterilisai secara mekanik (filtrasi)

Di dalam sterilisai secara mekanik (filtrasi), menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.

Jika terdapat beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan atau penguraian, maka sterlisasi yang digunakan adalah dengan cara mekanik, misalnya dengan saringan. Didalam mikrobiologi penyaringan secara fisik paling banyak digunakan adalah dalam penggunaan filter khusus misalntya filter berkefeld, filter chamberland, dan filter seitz. Jenis filter yang dipakai tergantung pada tujuan penyaringan dan benda yang akan disaring.

Penyaringan dapat dilakukan dengan mengalirkan gas atau cairan melalui suatu bahan penyaring yang memilki pori-pori cukup kecil untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan akan tercemar sedangkan cairan atau gas yang melaluinya akan steril. Alat saring tertentu juga mempergunakan bahan yang dapat mengabsorbsi mikroorganisme. Saringan yang umum dipakai tidak dapat menahan virus. Oleh karena itu, sehabis penyaringan medium masih harus dipanasi dalam otoklaf. Penyaringan dilakukan untuk mensterilkan substansi yang peka tehadap panas seperti serum,enzim,toksin kuman,ekstrak sel,dsb.

· Menyaring cairan

Hal dapat dilakukan dengan berbagai filter seperti saringan Seitz, yang menggunakan saringan asbestos sebagai alat penyaringannya; saringan berkefeld, yang mempergunakan filter yang terbuat dari tanah diatom; saringan chamberland, yang mempergunakan filter yang terbuat dari porselen; dan fritted glass filter, yang mempergunakan filter yang terbuat dari serbuk gelas. Saringan asbes lebih mudah dan lebih murah daripada saringan porselen. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakai, sedangkan saringan porselen terlalu mahal bila dibuang, tetapi terlalu sulit untuk dibersihkan.

· Menyaring udara

Untuk menjaga suatu alat yang sudah steril agar tidak tercemar oleh mikroba atau untuk menjaga agar suatu biakan kuman tidak tercemar oleh kuman yang lain, maka alat-alat tersebut harus ditutup denagn kapas, karena kapas mudah ditembus udara tetapi dapat menahan mikroorganisme. Harus dijaga agar kapas tidak menjadi basah, oleh karena kapas yang basah memungkinkan kuman menembus kedalam. Untuk mencegah pencemaran oleh kuman-kuman udara pada waktu menuang perbenihan, dapat dipergunakan suatu alat yang disebut laminar flow bench dimana udara yang masuk kedalamnya disaring terlebih dahulu dengan suatu saringan khusus. Saringan ini ada batas waktu pemakaiannya dan harus diganti dengan yang baru apabila sudah tidak berfungsi lagi.

2.    Sterilisasi secara fisik

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

· Pemanasan

a.    Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b.    Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180⁰C. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c.    Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d.    Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf

· Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV

3.    Sterilisaisi secara kimiawi

Biasanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. Antiseptik kimia biasanya dipergunakan dan dibiarkan menguap seperti halnya alkohol. Umumnya isopropil alkohol 70-90% adalah yang termurah namun merupakan antiseptik yang sangat efisien dan efektif. Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya disinfeksinya. Dengan atau iodium, isopropil tidak efektif terhadap spora. Solusi terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol, tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik.

Pemilihan antiseptik terutama tergantung pada kebutuhan daripada tujuan tertentu serta efek yang dikehendaki. Perlu juga diperhatikan bahwa beberapa senyawa bersifat iritatif, dan kepekaan kulit sangat bervariasi. Zat-zat kimia yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain yaitu halogen (senyawa klorin, iodium), alkohol,fenol,hidrogen feroksida,zat warna ungu kristal, derivat akridin, rosanalin, detergen, logam berat (hg,Ag,As,Zn), aldehida, dll.

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang membutuhkan teknik

· Desinfeksi meja kerja

a.    Singkirkan semua barang yang tidak diperlukan dari meja dan ruang kerja

b.    Semprotkan meja kerja denga alkohol 70 % beberapa kali hingga merata

c.    Kemudian semprotkan lagi alkohol pada tlapak tangan

d.    Letakkan alat dan bahan-bahan yang diperlukan pada meja kerja dan semprotkan kembali alkohol pada semua peralatan.

e.    Setelah itu diamkan beberapa saat dan kembali semprotkan alkohol ke seluruh permukaan tangan ketika hendak mulai bekerja.

f.    Letakkan pembakar spiritus lalu biarkan.

· Memindahkan Biakan secara Aseptis

a.    Persiapkam alat dan bahan seperti spirirtus,jarum inokulum(jarum ose),rak tabung dan dua buah tabung tertutup yang berisi biakan bakteri/virus.

b.    Bakarlah ujung hingga pangkal jarum inokulum dengan pembakar spirirtus.

c.    Buka tutup kedua tabung dan bakar mulut kedua buah tabung tersebut dengan pembakar spiritus agar kontaminan mati.

d.    Ambil satu ulasan pada tabung pertama dengan jarum inokulum kemudian masukkan jarum tadi pada tabung kedua dengan teknik spread zig-zag.

e.    Bakar kembali mulut tabing agar kontamina pada proses transfer mati.

f.    Tutup kembali tabung tersebut, dan bakar ujung jarum inokulum untuk memebunuh sisa bakteri yang ada.

· Memindahkan Biakan dari Cawan

a.    Persiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

b.    Bakar mulut cawan bagian tepi dengan memutarnya di atas api, serta pijarkan jarum inokulum dan di dinginkan.

c.    Buka mulut cawan yang berisi biakan koloni dan ambil koloni tunggalnya dengan menempelkan jarum inokulum loop.

d.    Kemudian tanamkan kembali koloni yang sudah diambil tadi pada media yang baru dengan teknik spread kontinyu.

e.    Panaskan kembali mulut cawan dan tutup rapat serta panaskanjarum inokulum yang telah digunakan.

· Memindahkan Cairan dengan pipet

a.    Persiapkan alat dan bahan-bahan yang akan digunakan.

b.    Lepaskan bungkus pipat dan panaskan ujung pipet pada pembakar spiritus. (Usahakan daerah ujung pipet berdekatan dengan api).

c.    Ambil dua buah tabung dan buka tutpnya untuk dipanaskan bagian ujung mulut tabung.

d.    Pipet cairan pada tabung pertama dengan menekan tombol S pada filter dengan volume tertentu. Kemudian pindahkan ke tabung lainnya dan keluarkan cairan tersebut dengan menekan E pada filter.

e.    Setelah itu bakar kedua mulut tabung tadi dan tutup kembali dengan rapat.

· Menuangkan Media

a.    Persiapkan alat dan bahan yang digunakan.

b.    Panaskan mulut erlenmeyer yang berisi media pertumuhan mikroorganisme.

c.    Tuangkan media dalam erlemneyer ke cawan petri yang berisi biakan murni.

d.    Ratakan dengan menggoyangkan cawan.

Prinsip cara kerja autoklaf

Autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121⁰C.

Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan.

Cara Penggunaan :

1.     Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2.    Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.

3.    Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.

4.    Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121^oC.

5.    Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

6.    Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 121⁰C dan tekanan 15 lb/in² (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121⁰C atau 249,8 ⁰F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100⁰C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 121⁰C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121⁰C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121⁰C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :

ü  Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

ü  Paelarut organik, seperti fenol

ü  Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sebagai berikut :

ü  Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat

ü  Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.

ü  Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar

ü  Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf

ü  Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0

Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer 2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yagn mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.

Tyndalisasi

Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.

Cara kerja :

·         Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan sumbat atau aluminium foil.

·         Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).

·         Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu 100⁰C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang terbentuk akan mematikan mikroba).

·         Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.

·         Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.

Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)

Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat gelas.

· Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil

· Atur pengatur suhu oven menjadi 180⁰C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.

Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet

Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui filter.

BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain.

Berbagai kelas Biological Safety Cabinet.

BSC yang dimiliki Lab mikrobiologi merupakan BSC kelas II yang memiliki konfigurasi udara seperti gambar disamping ini. Udara yang berasal dari luar kabinet akan langsung terserap masuk kesaluran bawah yang bergabung dengan udara dari meja kerja yang dimungkinkan mengandung bakteri yang digunakan untuk kerja. Udara dari meja kerja disedot dari depan meja kerja. Kemudian udara kotor ini disaring oleh penyaring HEPA dan disirkulasikan keluar kabinet atau kembali lagi ke meja kerja sebagai udara bersih.